Nos últimos anos, vários resultados de pesquisa foram estabelecidos em vários compostos naturais que demonstraram ter antioxidante benéfico e outras atividades biológicas. O mecanismo de defesa antioxidante desempenha um papel vital no combate a várias doenças, principalmente devido ao estresse oxidativo.
No entanto, vários modelos foram utilizados para identificar suas bioatividades usando esses compostos (quercetina, ácido gálico e curcumina). Seu nível de toxicidade também deve ser explorado para determinar os níveis de limiar no uso desses compostos. Neste estudo, investigamos a concentração letal desses compostos e anormalidades, alterações bioquímicas e morfológicas no embrião de peixe-zebra (Danio rerio). O nível de toxicidade foi avaliado calculando o LD50 nos estágios embrionários às 24, 48 e 72h. Parâmetros antioxidantes como superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa (GSH) e ensaios biológicos como peroxidação lipídica e estimativa de proteínas foram realizados. Avaliações microscópicas também foram observadas para descobrir anormalidades morfológicas. No entanto, esses compostos derivados naturalmente têm seu papel protetor e curativo em muitas complicações de saúde. A partir dos ensaios acima, estamos estudando o efeito dos medicamentos de maneira bioquímica e molecular no organismo modelo de peixe-zebra.
Palavras-chave peixe-zebra; Danio rerio; quercetina; ácido gálico; curcumina; toxicidade
1969
INTRODUÇÃO
O interesse crescente por vários compostos derivados de plantas, como quercetina, ácido gálico e curcumina, tem sido observado nas últimas duas décadas devido aos vários benefícios à saúde que esses compostos possuem. No entanto, o efeito tóxico de tais compostos deve ser avaliado com outros modelos animais alternativos, como Danio rerio (peixe-zebra), Artemia salina (camarão em salmoura), Caenorhabditis elegans (lombriga), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), Galleria mellonella (mariposa-maior) ) e assim por diante.
Quercetina é derivada da palavra latina quercous, que significa “carvalho”. O nome é usado desde 1857 e é derivado do quercetum (floresta de carvalhos) após “Quercus”. Quercetina, ou seja, 3,3 ′, 4 ′, 5 , 7-penta-hidroxiflavona, que é um flavonóide. Frutas como maçã, bagas, etc., e alguns vegetais, como cebola, brócolis, etc., são abundantes em quercetina.2-4) Existem formas livres e limitadas de quercetina em combinação com carboidratos e álcoois nas plantas. As principais funções da quercetina incluem sua capacidade de agir como um agente antioxidante, anti-inflamatório, antibacteriano e antiviral, útil no tratamento de várias condições, sendo a obesidade e as doenças cardiovasculares duas delas.5–7) No entanto, um estudo recente afirma que a dosagem mais alta de quercetina para exposição a longo prazo levou a toxicidade e carcinogenicidade quando administrada em ratos machos e fêmeas.8) A administração oral de quercetina mostrou LD50 a 161mg / kg em ratos e
† Endereço atual: Biocon Limited; Cidade eletrônica, Bengaluru – 560 100, Índia.
*Para quem a correspondência deve ser endereçada. e-mail: godwinj@vit.ac.in
159 mg / kg no rato. Administração subcutânea LD50 a 97mg / kg e administração intravenosa de aproximadamente 18mg / kg no modelo de camundongo.
O ácido gálico é um composto de polifenol que é quimicamente denominado ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico. Sabe-se que compostos polifenólicos elucidam propriedades antioxidantes, além de anticâncer, antibacteriano, antiviral, anti-úlcera, anticolesterol e vários outros.10-12) A capacidade de eliminação de radicais deste composto é de importância farmacológica.13) O ácido gálico mostrou muito potencial como agente terapêutico e preventivo para doenças que envolvem estresse oxidativo, como doenças cardiovasculares, distúrbio neurodegenerativo, câncer e até envelhecimento.
O ácido gálico é o componente ativo do vinho tinto, chá verde e frutas, responsável pela redução da doença arterial coronariana (DAC) e da trombose arterial.14,15) O ácido gálico também tem sido relatado para melhorar a tolerância à glicose, o colesterol total, concentração de triglicerídeos e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) em animais obesos induzidos por dieta.16,17) Por outro lado, a anormalidade baseada na dose foi relatada em ratos F344 em ambos os sexos, o que inclui redução da concentração de hemoglobina, hematócrito e contagem de glóbulos vermelhos e aumento de reticulócitos. Todos esses resultados indicaram que 5% do ácido gálico era tóxico, o que leva à anemia hemolítica e à hipertrofia hepática.18) A administração intravenosa e intraperitoneal de ácido gálico mostrou LD50 no camundongo a 320mg / kg e 4300mg / kg, respectivamente. A administração oral mostrou LD50 a 5g / kg no modelo de coelho.
A curcumina é um polifenol derivado da planta Curcuma longa. Quimicamente, é denominado 1,6-heptadieno-3,5-diona-1,7-
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forte atividade antioxidante comparável à das vitaminas C e E. Foi demonstrado ser um potente limpador de uma variedade de espécies reativas de oxigênio, incluindo radicais ânion superóxido, radicais hidroxila e radicais dióxido de nitrogênio, que geralmente deterioram as biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, especialmente danos ao DNA.20,21) A unidade hidroxifenil na curcumina demonstrou ser crucial para sua atividade anti-inflamatória.22) A administração intraperitoneal de curcumina mostrou LD50 no camundongo a 1500mg / kg.9)
O peixe-zebra (Danio rerio), um peixe de água doce de tamanho pequeno usado amplamente como um poderoso organismo modelo para o estudo da biologia vertebrada, sendo bem adequado para análises de desenvolvimento e genética é um organismo modelo em muitos campos como genética, biologia do desenvolvimento, toxicologia, farmacologia e assim por diante.23) O genoma do peixe-zebra é aproximadamente 71% homólogo do de um humano e 84% dos genes associados a doenças humanas têm uma contrapartida de peixe-zebra.24) Outras vantagens de usar o peixe-zebra como modelo como é pequeno e fácil de manter e reproduzir em menos espaço, também é opticamente transparente, o que facilita a observação das mudanças que ocorrem. Os produtos químicos para medicamentos podem ser facilmente fornecidos por adição à água; a possibilidade de usar amostras de tamanhos grandes; tempo de geração curto. Institutos Nacionais de Saúde trazendo esse sistema modelo para todo o seu potencial para o estudo da biologia, fisiologia e doenças humanas dos vertebrados.25,1)
Este estudo foi desenvolvido para investigar várias alterações bioquímicas na exposição à quercetina, ácido gálico e curcumina no peixe-zebra (Danio rerio). No entanto, esses compostos foram avaliados quanto à toxicidade em outros modelos, como ratos Wistar, camundongo e coelho. É o primeiro relato de quercetina e ácido gálico na avaliação da toxicidade do desenvolvimento em modelo de embrião de peixe-zebra; como o uso do peixe-zebra como modelo animal experimental tem muitas vantagens, o peixe-zebra possui alta fecundidade. Verifica-se que a eclosão dos ovos e a organogênese ocorrem rapidamente.
Ao contrário de outros modelos de mamíferos, eles se desenvolvem fora do útero, o que torna possível criá-los em placas de Petri ou em placas de vários poços contendo água. Eles podem ser usados para experimentos larvais a partir do terceiro dia após a fertilização (dpf). Os embriões também são transparentes.26) Para padronizar a toxicidade de medicamentos nesse modelo, foi calculada a dose letal de cerca de cinquenta por cento (LD50) e estimou-se seu papel no estresse oxidativo, reduzindo o nível de antioxidantes. Estudos de enzimas antioxidantes, medindo biomarcadores, como a peróxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase lipídica, glutationa (GSH) e ensaios biológicos, como peroxidação lipídica, estimativa de proteínas foram analisados.
MATERIAIS E MÉTODOS
Produtos químicos Os compostos de fármaco para avaliação da toxicidade (Quercetina, ácido gálico e curcumina) foram adquiridos à Sigma-Aldrich. Dimetilsulfóxido (DMSO) de Himedia, Índia. O meio embrionário (meio E3) foi preparado e as abordagens de toxicidade foram seguidas usando métodos padrão das diretrizes 236 da OCDE.
Criação de peixes e embriões de peixes Os peixes-zebra do tipo selvagem (Danio rerio) foram obtidos da Universidade Madurai Kamaraj, Madurai, Tamilnadu. Após a aclimatação, o melhoramento foi realizado em nosso laboratório. Os peixes foram mantidos para desova no início da manhã. Em seguida, todos os embriões foram coletados e lavados completamente com meio E3 e foram transferido para uma placa de Petri onde os embriões saudáveis e os mortos foram separados. Os embriões saudáveis foram selecionados às 6h pós-fertilização (hpf), observando-os sob um microscópio. A alimentação não é necessária para a 7d após a fertilização, pois a nutrição necessária é recebida do saco vitelino.27).
Exposição de embriões e larvas de peixe-zebra Os ovos fertilizados saudáveis às 6h após a fertilização (hpf) foram transferidos para uma placa de cultura de células de 24 poços. Cerca de 10 embriões foram coletados em cada poço com diferentes concentrações da solução do medicamento (10, 50, 100, 200 e 500μg / mL). O tratamento com cada solução foi realizado em triplicatas. Os embriões com soluções medicamentosas foram incubados a 28 ± 1 ° C por diferentes períodos de tempo (24, 48 e 72h). Em cada ponto de verificação, os embriões mortos foram contados para o cálculo da taxa de mortalidade (%) e os embriões vivos / larvas chocadas foram usados para o experimento posterior.
Teste da superóxido dismutase (SOD) A atividade da SOD foi medida pela capacidade da enzima de inibir a redução fotoquímica do cloreto de nitroblue-tetrazólio (NBT). Uma mistura de reação (consistindo em tampão fosfato 50mM (pH 7,8), ácido etilenodiaminotetraacético 100μM (EDTA), metionina 130mM, NBT 750μM, riboflavina 20μM e riboflavina 20μM e sobrenadante enzimático 50μL) foi misturada e iluminada com a ajuda de um fluorescente de 4000 lx lâmpada por 15 min. Após a iluminação, a absorbância foi medida em 560 nm usando um espectrofotômetro visível no UV.28)
CAT A atividade do CAT é determinada com a ajuda do espectrofotômetro visível no UV. O tampão fosfato contendo 2 mM de H2O2 é adicionado em uma cubeta experimental à qual o extrato enzimático é adicionado e bem misturado. A atividade da enzima é determinada descobrindo a absorvância usando a absorbância visível do espectrofotômetro UV Shimadzu a 240 nm em um espectrofotômetro. A absorvância diminui quando o peróxido de hidrogênio é degradado pela enzima CAT e sua atividade pode ser determinada.28)
GSH reduzido GSH é analisado pelo procedimento de Moron et al.29) A conversão de GSH oxidado em GSH reduzido é catalisada pela GSH redutase com a ajuda de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) como substrato em que a quantidade de NADPH representa enzima atividade. Para prosseguir com o experimento, foram adotados padrões GSH de diferentes concentrações (100, 200, 500 e 1000μg / mL) aos quais foram adicionados soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) para fazer o volume total de 3 mL. Após incubação por 10 min, a absorvância foi obtida utilizando espectrofotômetro a 412 nm. Uma curva padrão foi plotada usando a absorvância obtida dos padrões GSH e, usando essa curva, o GSH presente na amostra foi determinado no software GraphPad Prism versão 5.01.29)
Ensaio de peroxidação lipídica A peroxidação lipídica é o ensaio biológico no qual a concentração de malondialdeído (MDA) é medida. MDA é o produto final formado a partir dos lipídios. Essa atividade do MDA pode ser determinada com a ajuda do espectrofotômetro visível no UV. Após 72 horas, poucas amostras dos embriões foram lisadas no tampão de lise e foram adicionadas com TCA ao homogenato lisado e, em seguida, centrifugação a 2500 rpm por 10 min. O sobrenadante foi coletado ao qual o ácido tiobarbitúrico (TBA) foi adicionado e mantido em banho-maria a 95 ° C por 10 min. O butanol foi adicionado ao sobrenadante seguido de centrifugação. A camada de butanol foi separada e a DO foi medida em
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Fig. 1. LD50 obtido em diferentes concentrações dos compostos selecionados (a - quercetina; b - ácido gálico ec - curcumina)
532 nm.30)
Estimativa de proteínas A quantidade de proteína nas 72h
embriões tratados com medicamentos foram estimados usando o método de Bradford. Cerca de 20 μL de homogeneizado de embrião tratado com fármaco foram adicionados com 80 μL de água destilada e 900 μL de reagente Bradford foram adicionados a ela e foram incubados por 5 minutos no escuro e verificados quanto à absorvância a 595 nm. A estimativa foi determinada usando-se slop padrão com a albumina sérica da videira como a proteína padrão variando de 0, 5, 10, 25, 50 e 100μg / mL.31)
Análise estatística Todos os dados foram feitos em triplicado e a porcentagem de mortalidade foi calculada usando o prisma Graph pad versão 5.01. Os dados são mencionados aqui como uma média ± desvio padrão (S.D.). A ANOVA unidirecional foi realizada para significância estatística usando o teste de comparação múltipla de Dunnett com p <0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito tóxico de compostos seletivos no embrião de peixe-zebra Foi relatado que a curcumina tem efeitos embriotóxicos e teratogênicos no desenvolvimento do peixe-zebra. A partir da exposição da curcumina pelo período de 24h, os valores de LD50 foram relatados como 7,5mM para embriões e 5mM para larvas, respectivamente.32) No caso do ácido gálico, foi relatado anteriormente como o LD50 em peixes-zebra adultos na dose de 100 mg / L.33) Este estudo é para avaliar a mortalidade usando quercetina, ácido gálico e curcumina em embrião de peixe-zebra para determinar seus valores de LD50. O tratamento dos embriões começou das 6 às 72hpf. Em nosso estudo, os resultados foram apresentados graficamente na Figura 1 como a, bec para quercetina, ácido gálico e curcumina, respectivamente. Os valores de LD50 para quercetina, ácido gálico e curcumina são 484, 304 e 135μg / mL, respectivamente. O estudo anterior mostrou comparativamente o efeito tóxico da cominho em peixe-zebra, mesmo em menor concentração.32) A partir disso, podemos ver que a quercetina tem a menor toxicidade e a curcumina mais tóxica dos três compostos.
Parâmetros antioxidantes Os antioxidantes desempenham um papel importante na defesa contra o estresse oxidativo e os radicais livres, como os radicais superóxidos (O2−), hidroxil (OH ·) e peróxido de hidrogênio (H2O2) .30) Os antioxidantes endógenos estão catalisando esses radicais livres para forma tóxica.
SOD
Os radicais superóxido são o agente oxidante preliminar que foi catalisado pela enzima SOD. A conversão do reagente NBT de cor amarela foi transformada em cristais de formazan por reação com radicais superóxido.34) O SOD inibirá a conversão do NBT, portanto, encontramos a menor formação de cristais na quercetina (10, 50 e 100μg / mL), embora o ácido gálico seja moderadamente menos tóxico, desencadeia a formação de superóxido. Assim, a intensidade é maior em 10 a 200μg / mL de ácido gálico, enquanto na curcumina é muito sensível na indução de toxicidade e a formação de formazan também é alta em toda a concentração. O aumento significativo da absorvância foi observado no tratamento com quercetina e ácido gálico. Enquanto uma diminuição significativa foi observada no tratamento com curcumina com peixe-zebra representado nas Figs. 2a, b e c.
GATO
Após o processamento do SOD, os radicais de peróxido de hidrogênio serão maiores. Ele deve ser convertido em uma forma não tóxica de H2O e O2 pela enzima endógena CAT. Aqui, os gráficos inferem que há mais atividade enzimática no controle em comparação com as amostras de teste para quercetina, ácido gálico e curcumina. Assim, ao realizar este ensaio antioxidante, afirma claramente que o nível de enzima CAT aumentou significativamente a exposição à quercetina e ao ácido gálico, enquanto na curcumina o CAT aumentou significativamente também diminuiu, devido à deterioração da defesa antioxidante contra a curcumina (Figs.
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Fig. 2. Os níveis de superóxido dismutase e catalase no homogeneizado de peixes tratados
Os valores de OD obtaína representados como média ± DP. [*, **, *** indica o aumento gradual, com o de controle em p <0,05.]
2d – f).
GSH reduzido
GSH é o único tipo de ensaio antioxidante em que o
A enzima GSH redutase catalisa a conversão do di-sulfureto de GSH em GSH reduzido. GSH reduzido protege do estresse oxidativo. E a enzima GSH peroxidase e GSH redutase utilizam o GSH para manter a homeostase normal.35) O relatório anterior usando a toxicidade hepática mediada por nanopartículas de prata (AgNPs) em peixe-zebra adulto mostrou como a concentração dos AgNPs (120 mg / L) aumenta, o nível de GSH aumenta aumenta para controlar o estresse oxidativo.36) Foi comparativamente semelhante o caso de quercetina e ácido gálico. Enquanto no caso da curcumina tem mais toxicidade, mesmo na dose mais baixa, o conteúdo de GSH parece ser maior e diminui significativamente à medida que a concentração de curcumina aumenta. Isso ocorreu devido ao conteúdo endógeno inadequado de GSH à medida que o estresse oxidativo aumenta. Após o período de incubação, o conteúdo de GSH foi estimado juntamente com o controle. A quercetina aumenta significativamente
a concentração de GSH quando comparada com outros compostos (Fig. 3).
Testes Bioquímicos
Teste de peroxidação lipídica
MDA é um dos peróxidos lipídicos formados quando tratados com compostos; quercetina, ácido gálico e curcumina em diferentes concentrações. Os resultados indicaram que, quando a concentração de compostos aumentou gradualmente de (10 a 500), o peixe-zebra acumulou os compostos e produziu maiores concentrações de MDA.37) O aumento significativo no conteúdo de MDA após a exposição de quercetina, ácido gálico e curcumina foram observados e representados na figura 4.
O conteúdo do MDA é um biomarcador amplamente utilizado para a oxidação lipídica de ácidos graxos devido à sua reação com o TBA. O teste de TBA baseia-se na reação do TBA em relação ao MDA para produzir uma cor vermelha fluorescente e foi usado anteriormente por químicos em alimentos para avaliar a degradação autoxidativa de gorduras e óleos.37) Em nosso experimento, a curcumina era mais tóxica do que a
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Fig. 3. O conteúdo total reduzido de glutationa obtido em diferentes concentrações de compostos selecionados (a - quercetina; b - ácido gálico ec - curcumina) foi determinado
Dados representados como média ± DP. [*, **, *** indica o aumento gradual da diferença significativa com o controle em p <0,05.]
Fig. 4. A estimativa dos níveis de proteína foi obtida para diferentes concentrações de compostos selecionados (a - quercetina, b - ácido gálico ec - curcumina) e seus dados foram representados como média ± DP.
[*, **, *** indica o aumento gradual da diferença significativa com o controle em p <0,05.]
outros compostos e o conteúdo observado de MDA em uma dose mais alta de curcumina mostraram 187,39 ± 0,57 ng / mL.
Estimação de proteínas
O conteúdo de proteínas foi estimado para caracterizar o efeito de cada medicamento separadamente. Com o aumento da concentração.
Na administração do medicamento, houve um declínio gradual no conteúdo de proteínas, que descreveu o efeito variável de cada medicamento nas larvas de peixe-zebra sob diferentes concentrações.
A estimativa de proteínas pelo método de Bradford é o experimento altamente utilizado na estimativa de proteínas devido à sua sensibilidade e
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Fig. 5. A estimativa dos níveis de proteína foi obtida para diferentes concentrações de compostos selecionados (a - quercetina, b - ácido gálico ec - curcumina) e seus dados foram representados como média ± DP.
[*, **, *** indica o aumento gradual da diferença significativa com o controle em p <0,05.]
Fig. 6. A anormalidade morfológica foi observada em concentrações mais altas de compostos selecionados e focalizada sob o microscópio de luz (4 ×)
A coluna "a" representa o controle seguido por "b-e" diferentes concentrações de compostos selecionados. [SC, curvatura da coluna vertebral; Dh, eclosão tardia e EP, edema pericárdico]
mais preciso que o método de Lowry.38) Em apoio ao experimento acima de tudo, o conteúdo de proteínas também foi reduzido significativamente à medida que a concentração aumenta (Fig. 5).
Deformação Morfológica Após a avaliação da toxicidade com diferentes concentrações, foram observadas anormalidades morfológicas e variações anatômicas em
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72hpf. Entre os três compostos, a curcumina elevou mais deformidades estruturais (Fig. 6), mesmo em menor concentração (5μg / mL) e as anormalidades, como curvatura espinhal (SC) e edema pericárdico (PE), aumentaram relativamente na concentração de 100μg / mL mL. A razão por trás da toxicidade da curcumina foi anteriormente relatada como; induziu a apoptose dependente da caspase-3 em células Jurkat humanas.39) O ácido gálico mostra PE e retardo de incubação (Dh) no tratamento a 200μg / mL, enquanto a quercetina mostrou anormalidades pericárdicas em concentrações mais altas (500μg / mL).
No relatório anterior, a curcumina mostrou o desenvolvimento
defeitos como caudas dobradas ou em forma de gancho, curvatura da coluna vertebral, edema no saco pericárdico, reabsorção retardada do saco vitelino, e menor comprimento corporal.32) Foi relatado que a quercetina mostrava as alterações morfológicas, incluindo curvatura do corpo levar o eixo a causar diminuição do desempenho locomotor. isso foi também afirmou que a quercetina em maior concentração afetava a Produção de ATP. Assim, o comportamento larval foi afetado por causar
40) locomoção.
Em nosso estudo, a toxicidade aguda desses compostos para este modelo foi previamente avaliada. Também ajuda a prevenir a angiogênese, inibindo a rede mediada pelo VEGFR2.34) Portanto, pode ser uma substância promissora para a atividade anticâncer. O ácido gálico, uma substância importante presente nas frutas e vegetais, a catequina é um dos derivados.
CONCLUSÃO
Das três drogas usadas para estimar a atividade tóxica das larvas de peixe-zebra, concluímos que a quercetina é menos tóxica que as outras duas drogas e foi confirmada usando ensaios bioquímicos, que proporcionaram menor atividade de peroxidação lipídica e maior teor de proteínas com um Valor de LD50, que proporcionou maior taxa de sobrevivência para o medicamento com quercetina.
Conflito de interesse Os autores declaram não haver conflito de interesse.
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Autores:
Rajendran Harishkumar, Lakki Pramod Kumar Reddy, Shivam H. Karadkar, Musa Al Murad, Saravanan Sibi Karthik, Saravanan Manigandan, † Chinnadurai Immanuel Selvaraj e JohnSamuel Godwin Christopher *, um
uma Escola de Biociências e Tecnologia (SBST), Vellore Institute of Technology (VIT); Vellore-632014, Índia: eb escola VIT de Inovações e Aprendizagem Avançada em Agricultura (VAIAL), Vellore Institute of Technology (VIT); Vellore-632014, Índia.
Recebido em 4 de abril de 2019; aceito em 19 de setembro de 2019
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